Ретикулиновые волокна импрегнируют серебром (само название «аргирофильные» говорит о сродстве этих волокон к солям серебра). После серебрения ретикулиновые волокна приобретают черный или коричнево-черный цвет.
Для успеха импрегнации при всех способах серебрения срезов необходимо точно соблюдать прописи, а также чистоту реактивов и посуды. Необходимо иметь отдельную стеклянную посуду для импрегнации. Каждый стаканчик или пипетку надо использовать только для одних и тех же растворов. Металлические приборы при серебрении употреблять нельзя.
Перед работой посуду тщательно обрабатывают смесью бихромата калия с серной кислотой, промывают в проточной воде в течение 1 ч и ополаскивают дистиллированной водой. После работы посуду также тщательно моют и ополаскивают дистиллированной водой. Особенно внимательно следует обращаться со стеклянной палочкой для переноса срезов, если для каждого раствора нет специальной палочки. Хранить такую палочку надо в дистиллированной воде и перед употреблением вытирать и ополаскивать чистой дистиллированной водой. Кристаллический нитрат серебра должен быть совершенно белым (серебро розового, серого и черного цвета непригодно к употреблению).
Спирохеты, микробиология, постулат #32
Для приготовления растворов всегда пользуются свежей дистиллированной водой.
Рабочие растворы
Раствор аммиаката серебра. К находящимся в посуде с притертой пробкой 10 мл 10% раствора нитрата серебра прибавляют 2 мл 10% гидроксида калия. В результате образуется темно-бурый осадок гидрата оксида серебра. Затем к этой смеси, одновременно взбалтывая, добавляют по каплям концентрированный раствор аммиака до тех пор, пока осадок не исчезнет. Затем добавлением дистиллированной воды объем раствора удваивают, фильтруют.
Раствор перманганата калия 1%.
Раствор метабисульфита калия 2—3%.
Раствор железоаммониевых квасцов 2% (пригодны только прозрачные лиловые кристаллы).
Кроме того, необходимо иметь 10% раствор формалина, 0,1% раствор хлорида золота, 1% раствор тиосульфата натрия.
Техника импрегнации
Срезы освобождают от парафина, помещают на 1—2 мин в раствор перманганата калия, а затем 5 мин промывают в водопроводной воде. После этого срезы переносят на 1 мин в раствор метабисульфита калия (для обесцвечивания) и затем снова промывают в проточной водопроводной воде в течение 5—10 мин.
Далее необходимо подержать срезы 1 мин в 2°/о растворе железоаммониевых квасцов и затем в течение 3—5 мин промыть сначала в водопроводной воде, а затем в двух порциях дистиллированной воды по нескольку мин. Срезы переносят в раствор аммиаката серебра на 1 мин, после чего очень быстро ополаскивают дистиллированной водой.
Затем срезы на 5 мин помещают в раствор формалина, который разбавляют водопроводной водой в соотношении 1 : 9, промывают водопроводной водой в течение 5 мин.
После промывки срезы сразу погружают в раствор хлорида золота на 10 мин. Далее ополаскивают их дистиллированной водой и для восстановления серебра погружают на 1 мин в раствор метабисульфита калия.
Г.Ш. Исаева. Спирохеты, часть 1. Возбудитель венерического сифилиса.
Следующая манипуляция — помещение срезов в 1 °7о раствор тиосульфата натрия на 1 мин (не дольше!) для фиксации. После этого необходимо основательное промывание водопроводной водой. Проводят срезы через спирты, ксилол и заключают в бальзам.
Результат. Ретикулиновые волокна приобретают интенсивно черный цвет, коллагеновые —коричневый или черный, ядра клеток — коричневый цвет.
Выявление элементов нервной системы
Для выявления элементов центральной и периферической нервной системы обычно применяют различные способы импрегнации (серебром, золотом, осмием). Окрашивать тела нервных клеток и их отростки можно и метиленовым синим. Все эти методы имеют тот существенный недостаток, что являются эмпирическими. Поэтому лаборанту всегда надо быть готовым к тому, что даже при строгом соблюдении всех условий импрегнации она часто не дает желаемого результата. Здесь имеют значение многие факторы, которые иногда трудно учесть (качество фиксации, реакция и качество воды, свойства нервной ткани и т. д.).
Существует много модификаций импрегнации нервных клеток и волокон. Наиболее распространенным является метод Бильшовского — Грос.
Окрашивание хроматофильного вещества в цитоплазме нервных клеток (глыбки Ниссля) производят по методу, предложенному Нисслем. Мякотные оболочки нервных волокон окрашивают по методу Шпильмейера или осмируют. Элементы глии выявляют специальными методами:
1) методом Кахала (выявление макроглии); 2) методом Белецкого (выявление микроглии).
Кроме указанных методов, всегда надо параллельно окрашивать срезы для обзорных целей гематоксилин- эозином, что позволяет увидеть взаимоотношения нервных элементов с окружающими тканями. Нервные клетки могут быть окрашены и другими методами, употребляемыми в гистологической технике.
Источник: lmed.in
Импрегнация серебром для выявления спирохет проводится по методу
Рекомендован для выявления аргирофильных ретикулярных волокон в соединительной ткани. Четкая и быстрая импрегнация в данном методе происходит по двум причинам: предварительная импрегнация солями железа и использование в качестве источника серебра нестабильного диаминного комплекса (аммонийный раствор), который более реактивен, чем нитрат серебра.
Обработка трехвалентным железом: после предварительного окисления перманганатом калия материал обрабатывается трехвалентным железом (аммоний-железо сульфат). Ионы железа, более реактивные, чем ионы серебра, быстро связываются с аффинными функциональными группами аргирофильных веществ. Обработка аммонийным раствором: серебро в данном растворе присутствует в виде комплексного растворимого в воде оксида — [Ag(NH3)2]2 OH. Катионы серебра из данного комплекса заменяют ионы железа в материале. Затем муравьиный альдегид путём восстановления приводит к образованию металлического серебра, обеспечивая его отложение на аргирофильных структурах и визуализацию.
[Ag(NH3)2]2 OH + HCHO = 2 Ag + 4 NH3 + HCOOH
Невосстановленный комплексный катион удаляется при помощи тиосульфата натрия (Na2S2O3) путём формирования растворимого комплекса, не поддающегося окислению.
Регистрационное удостоверение РЗН 2013/775 от 23.03.2015 на Реагенты для проведения пробоподготовки, окрашивания и заключения под покровное стекло гистологических и цитологических препаратов по ТУ 9398-001-89079081-2012
Источник: biovitrum.ru
СЕРЕБРЕНИЯ МЕТОДЫ
СЕРЕБРЕНИЯ МЕТОДЫ (син. методы импрегнации серебром) — способы выявления тканевых и клеточных компонентов (структур) путем пропитывания гистологических препаратов солями серебра. Серебрения методы относятся к методам импрегнации тканевых структур солями металлов (см. Импрегнация).
Восстановление (редукция) металлического серебра приводит к осаждению его на определенных структурах, к-рые приобретают коричневый или черный цвет. Среди тканевых компонентов различают аргентаффинные, в к-рых редукция серебра осуществляется в темноте за счет их собственных восстановительных свойств (см.
Аргентаффинные клетки), и аргирофильные, в к-рых серебро осаждается только под действием света или хим. восстановителей (см. Аргирофильность). Сущность Серебрения методов остается не вполне ясной, большинство этих методов основано на эмпирических разработках. По-видимому, в феномене аргентаффинности определенная роль принадлежит присутствию в клетках производных катехоламинов (см.), а развитие аргирофилии связано, в, частности, с наличием в тканевых компонентах сульфгидрильных групп (SH-групп) и ненасыщенных жирных к-т.
Из солей серебра для С. м. обычно используют 0,5—20% р-ры нитрата серебра, нередко в виде аммиачного серебра (см. Бильшовского — Грос — Лаврентьева метод). Применяют также ацетат, карбонат, пикрат, лактат серебра, протаргол и др. Во всех случаях для С. м. требуются химически чистые реактивы и посуда; работать следует стеклянными иглами, избегая соприкосновения препаратов с металлом.
В зависимости от цели С. м. проводят либо на свежих, нефиксированных препаратах, либо после фиксации, чаще 10—20% р-ром формалина. Без фиксации С. м. выявляют межклеточные границы эпителия и мезотелия (см. Ранвье методы). Серебро может служить также агентом, фиксирующим ткань.
Фиксирующие свойства р-ров серебра используют при импрегнации выстилки альвеол по методу Эберта, когда через бронх или трахею наполняют долю или все легкое 0,5% р-ром нитрата серебра с последующим УФ-об-лучением замороженных срезов легкого, а также для выявления нейрофибрилл в свежих кусочках ткани мозга (см. Рамон-и-Кахаля методы).
Дин и Морс (Н. W. Deane, A. Morse, 1948) предложили использовать восстановительные свойства аскорбиновой к-ты (витамина С) для выявления ее включений в тканях: свежие кусочки ткани обрабатывают насыщенным р-ром нитрата серебра в смеси спирта, воды и ледяной уксусной к-ты, затем их переносят в кислый фиксаж, обезвоживают и заливают в парафин. Под микроскопом включения витамина С наблюдаются в виде черных точек.
На фиксированных препаратах С. м. позволяют элективно выявлять многие элементы нервной ткани (нервные клетки, нейрофибриллы, нейроглию, осевые цилиндры и узлы миелиновых нервных волокон, безмиелиновые волокна, нервные окончания), аргирофильные волокна соединительной ткани, аргентаффинные клетки желудка и кишечника (аргентаффиноциты), хромаффинные клетки надпочечников и параганглиев, нек-рые пигменты, а также известь (см. Коссы способы) и др.
Методы серебрения применяют также в бактериологии (см. Левадити метод), вирусологии (см. Морозова метод), цитологии — импрегнация комплекса Гольджи (см, Гольджи комплекс), выявление ядрышковых организаторов (см. Ядрышко).
Разработан ряд вариантов С. м. для выявления определенных элементов нервной ткани в различных отделах нервной системы. Эти варианты различаются по составу фиксирующих смесей и способам редукции серебра. Так, элементы нервной ткани изучают либо путем обработки серебром целых кусочков ткани (тотальная импрегнация) с последующим изготовлением срезов, напр, при тотальной импрегнации с пиридином по Бильшовскому, варианте этого способа — методе Буке, а также при использовании методов Гольджи, Рамон-и-Кахаля (см. Гольджи метод, Рамон-и-Кахаля методы), либо путем импрегнации замороженных срезов (см, Бильшовского — Г рос — Лаврентьева метод, Миягавы — Александровской метод, Ортеги методы). Периферические нервы и их окончания хорошо выявляются по методу Кампоса, представляющего собой модификацию метода Билыновского — Грос— Лаврентьева.
Для серебрения аргирофильных волокон (см.) на срезах соединительной ткани применяют различные варианты предложенного в 1904 г. для выявления нейрофибрилл метода Бильшовского (см. Бильшовского — Грос — Лаврентьева метод). Мареш (R. Maresch, 1905) применил этот метод для импрегнации фибрилл соединительной ткани.
В методе Фута до импрегнации до методу Бильшовского замороженные срезы обрабатывают р-рами перманганата калия и щавелевой к-ты. Импрегнация аргирофильных волокон по методу Валльгрена в настоящее время почти не применяется. Применяют также метод Ачукарро в модификациях Ортеги (Р. del Rio Hortega) для замороженных срезов и Кларфельда (Klarfeld) — для целлоидиновых срезов (см. Ортеги методы).
Хорошие результаты дают также методы, предложенные П. Е. Снесаревым для замороженных и парафиновых срезов (см. Снесарева методы).
При всех С. м. быстрое прекращение серебрения достигается путем погружения препаратов в аммиачную воду (разведенный в три раза 25% р-р аммиака). Избыточное осаждение серебра можно устранить дифференцировкой в 0,25% р-ре перманганата калия, 2% р-ре персульфата аммония и др. После применения С. м. срезы можно тонировать р-рами солей золота (см. Золочения методы).
Библиография: Лилли Р. Патогистологическая техника и практическая гистохимия, пер. с англ., с. 216, 222, М., 1969; Меркулов Г. А. Курс патологогистологической техники, с. 181, Л., 1969; Ромейс Б. Микроскопическая техника, пер. с нем., с. 309, М., 1954.
Источник: xn--90aw5c.xn--c1avg