РАМОН-И-КАХАЛЯ МЕТОДЫ (S. Ramon у Cajal, испанский гистолог, 1852 — 1934) — гистологические методы выявления структур нервной ткани путем обработки препаратов солями тяжелых металлов (импрегнации), предложенные С. Рамон-и-Кахалем. Среди этих методов различают модификацию метода Гольджи, направленную на выявление нейроцитов, метод выявления нейрофибрилл и методы импрегнации нейроглии.
Модификация метода Гольджи, разработана в 1888 г. Обработанные по методу Гольджи (см. Гольджи метод) кусочки ткани снова погружают в уже бывшие в употреблении жидкости — сначала в р-р, содержащий бихромат калия и осмиевую к-ту, затем в р-р азотнокислого серебра.
Метод выявления нейрофибрилл, предложенный в 1903 г., основан на восстановлении серебра в импрегнированиой нервной ткани. С. Рамон-и-Кахалем предложено несколько модификаций этого метода применительно к разным объектам. Для выявления нейроцитов коры головного мозга и зерновидных нейроцитов (клеток-зерен) мозжечка свежие кусочки ткани выдерживают в 0,75—3% р-ре азотнокислого серебра при 1° 35° в течение 3—5 дней до появления табачно-коричневой окраски, после этого их промывают в дистиллированной воде в течение 1 мин. и переносят на 24 часа в жидкость, содержащую 1 — 2 г пирогалловой к-ты или гидрохинона, 5 мл нейтрального формалина и 100 мл дистиллированной воды, снова промывают и заключают в целлоидин или парафин.
Нервная ткань. Классификация нейронов и нейроглии. Нервное волокно.
Методы импрегнации нейроглии
1. Импрегнация золотом с сулемой предложена в 1926 г. Кусочки ткани фиксируют в бром-формоле (15 мл нейтрального формалина, 85 мл дистиллированной воды и 2 г бромистого аммония) в течение 2—20 дней, замороженные срезы переносят в фиксирующую жидкость, ополаскивают в воде и помещают на 4—8 час. при 7° 18—22° в свежеприготовленный р-р, содержащий 0,5—0,8 г сулемы в 50 мл дистиллированной воды. В этот р-р добавляют 6 мл 1% р-ра химически чистого хлорного золота. Затем срезы хорошо промывают и фиксируют 6—10 мин. в 5% р-ре гипосульфита натрия или в фиксаторе Рамон-и-Кахаля (70 мл 5% р-ра гипосульфита натрия, 30 мл 96% спирта и 5 мл концентрированного р-ра бисульфита натрия), обмывают в 50% спирте, переносят на предметное стекло, обсушивают фильтровальной бумагой, наносят абсолютный спирт, затем оригановое масло, ксилол, бальзам. Клетки нейроглии окрашиваются в пурпурно-красный цвет.
2. Импрегнацию серебром с бром-формолом, предложенную в 1924 г., применяют для изучения глиоцитов и их отростков. Этот метод позволяет также выявить базофильное вещество (тельца Ниссля) в нейроцитах. Кусочки ткани фиксируют бром-формолом, как в предыдущем методе, замороженные срезы помещают в усилитель (70 мл дистиллированной воды, 30 мл нейтрального формалина и 3 г бромистого аммония), промывают дистиллированной водой и погружают на 5—10 мин. в смесь, содержащую 10 мл аммиачного серебра, 10—12 мл дистиллированной воды и 7— 10 капель пиридина. Затем смесь подогревают до приобретения срезами табачной окраски, промывают 2 раза в дистиллированной воде, восстанавливают в 5% нейтральном формалине в течение 2—3 мин., золотят в 0,2% р-ре хлорного золота, фиксируют в 5% р-ре гипосульфита натрия, промывают, обсушивают, обезвоживают спиртом и ксилолом и заключают в бальзам.
Пирамидные нейроны. Гистологическое строение коры больших полушарий.
3. Метод импрегнации ураном с формолом, предложенный в 1912 г., используют для окрашивания гранул протеина и капель жира в глиоцитах. Этот же метод с укороченным временем фиксации применяют для выявления комплекса Гольджи.
Библиография: Ромейс Б. Микроскопическая техника, пер. с нем., М., 1954; R а-тбп у С a j а 1 S. Sobre un sencillo procéder de impregnaciön de las fibrillas interiores del protoplasma nervioso, Arch, lat. med. biol., Madrid, v. 1, p. «3, 1903; он же, Elementos de técnica microgrâfica de] sistema nervioso, Madrid, 1933.
В. С. Сперанский.
Источник: xn--90aw5c.xn--c1avg
Название препарата: Поперечный срез спинного мозга собаки
Положите препарат так, чтобы задняя или дорзальная часть (включающая узкие задние рога) лежала сверху, а передняя – снизу в поле зрения. Обратите внимание на тонкую, интенсивно прокрашенную, прерывистую мягкую мозговую оболочку, покрывающую спинной мозг снаружи, в которой можно рассмотреть кровеносные сосуды.
На поверхности спинного мозга, в некоторых случаях, можно обнаружить остатки передних и (или) задних корешков. Непосредственно в спинном мозге обратите внимание на расположенное по периферии белое вещество спинного мозга (продольно расположенные миелиновые волокна на поперечном срезе и клетки глии), образующее: между передними рогами — передние канатики, между задними рогами — задние канатики, а между передним и задним рогами каждой половины спинного мозга – боковые канатики.
Не забудьте, что задние канатики друг от друга отделены задней срединной перегородкой, а передние – передней срединной вырезкой. Найдите расположенное в центре спинного мозга, более интенсивно окрашенное серое вещество (тела мультиполярных клеток, нервные волокна и клетки глии), имеющее вид бабочки или буквы «Н». В нем выделите узкие и длинные задние (дорзальные) рога, в которых находятся ассоциативные мультиполярные нейроны и широкие закругленные передние рога (вентральные), содержащие крупные эфферентные мультиполярные нейроны. Все нейроны как передних так и задних рогов лежат группами – ядрами, формирующими спинальные ядерные нервные центры. В центре спинного мозга найдите центральный спинномозговой канал, выстланный эпендимной глией.
Протокол № 3
(для всех факультетов)
Название препарата: Кора мозжечка (срез мозжечка собаки)
Окраска: импрегнация азотнокислым серебром по Кахалю
Малое увеличение:
Обратите внимание на своеобразный рисунок поперечно срезанных извилин мозжечка – древо жизни и на взаиморасположение серого и белого вещества в препарате.
Белое вещество (нервные волокна) имеет вид узких полосок, окрашенных на одних препаратах светлее серого вещества, в других, наоборот, интенсивно импрегнированно в черный цвет. Следует отметить лежащую снаружи от коры мозжечка тонкую полоску интенсивно окрашенной мягкой мозговой оболочки с кровеносными сосудами на поперечном срезе.
Серое вещество значительно шире белого, в нем вы можете видеть три слоя: молекулярный, ганглиозный и зернистый. Основной точкой для дифференцировки слоев следует считать расположенные в один ряд крупные тела грушевидных клеток Пуркинье, лежащих в ганглиозном слое. Их мощные четко определяемые дендриты — «рога оленя» уходят в молекулярный слой, а практически невидимые аксоны прободают зернистый слой и уходят в белое вещество, образуя эфферентные пути мозжечка.
У основания полушария в белом веществе (противоположная от коры мозжечка сторона) найдите скопления тел мультиполярных нейронов, формирующих ядро мозжечка.
Большое увеличение: Рассмотрите каждый слой в отдельности:
1. Молекулярный слой содержит немного мелких тел клеток, а также большое количество восходящих и нисходящих волокон. В верхних 2/3 можно найти большие и малые звездчатые нейроны, а в нижней 1/3 мелкие полигональные корзинчатые клетки. И те и другие являются тормозными для клеток Пуркинье.
2. Ганглиозный слой содержит только проекционные эфферентные грушевидные нейроны — клетки Пуркинье.
3. Зернистый слой богат нейронами, преимущественно встречаются клетки-зерна (лежат группами – сферулами), которые и придают ему зернистый вид. Эти клетки являются возбуждающими для клеток Пуркинье, а также клеток Гольджи и звездчатых клеток. Кроме них здесь можно встретить более крупные длинноаксонные и короткоаксонные клетки Гольджи и веретеновидные клетки. Последние две группы клеток являются по функции тормозными для клеток-зерен. Афферентные волокна этого слоя представлены лиановидными и моховидными волокнами. ( лиановидные волокналучше видны в молекулярном слое, они обвивают дендриты клеток Пуркинье).
Протокол № 4
(для лечебного и педиатрического факультетов)
Название препарата: Кора больших полушарий
(конвекситальный срез головного мозга собаки)
Источник: cyberpedia.su
Окраска: серебрение по Кахалю.
Изучите препарат без микроскопа. Препарат представляет собой срез кусочка коры больших полушарий головного мозга собаки. Препарат окрашен с использованием методики серебрения и имеет характерную тёмно-коричневую окраску. Методики серебрения позволяет выявлять границы нервных клеток, в том числе ветвление их отростков.
Обратите внимание на неровную наружную поверхность полушарий головного мозга, что обусловлено наличием борозд и извилин. Наружная поверхность коры покрыта мягкой мозговой оболочкой, образованной рыхлой соединительной тканью и содержащей кровеносные сосуды. Обратите внимание на наличие в препарате серого и белого вещества. Серое вещество окрашено темнее и располагается на периферии среза, белое вещество окрашено светлее и окружено серым веществом.
Малое увеличение. Получите изображение препарата на малом увеличении, оцените форму среза, особенности окраски, распределение серого и белого вещества.
Изучите строение серого вещества коры больших полушарий головного мозга, обратите внимание на наличие в сером веществе тел нейронов. Нейроны окрашены в темно-коричневый или черный цвет. Обратите внимание на то, что нервные клетки чаще всего имеют треугольную или пирамидную форму и располагаются закономерно: пирамидные нейроны располагаются «вершиной» в направлении к поверхности извилины, основание обращено в сторону белого вещества, размеры нейронов увеличиваются по мере удаления от поверхности извилины. Ближе к поверхности располагаются малые пирамидные нейроны. В глубине серого вещества располагаются гигантские пирамидные нейроны Беца ****** . Тела нейронов окружают переплетение аксонов, дендритов, отростков клеток нейроглии, обозначаемая термином «нейропиль».
Изучите строение белого вещества. Найдите нервные волокна, ядра клеток нейроглии.
В сером и белом веществе найдите кровеносные сосуды, имеющие вид округлых, овальных или вытянутых полостей, заполненных зернистой эритроцитарной массой.
Большое увеличение. В сером веществе найдите пирамидный нейрон, определите ядро клетки и отростки. В белом веществе найдите нервные волокна и ядра клеток нейроглии.
Рисунки в атласе: №№159а, б, в.
Препарат зарисовать и на рисунке обозначить:
1. Серое вещество:
1.1. малые пирамидные клетки;
1.2. средние пирамидные клетки;
1.3. гигантские пирамидные клетки Беца;
1.4. клетки нейроглии;
2. Белое вещество:
2.1. нервные волокна;
2.2. клетки нейроглии.
ПРЕПАРАТ № 117. Кора мозжечка.
Окраска: серебрение по Кахалю.
Изучите препарат без микроскопа. Препарат представляет собой срез кусочка мозжечка собаки, окрашенный с использованием методики серебрения, что позволяет выявлять границы клеток и ветвление их отростков.
Препарат имеет характерную тёмно-коричневую окраску. Обратите внимание на неровную поверхность мозжечка, что обусловлено наличием борозд и извилин. Определите серое и белое вещество: серое вещество располагается по периферии извилин, белое вещество – в центре.
Малое увеличение. Изучите строение серого и белого вещества. Серое вещество имеет значительную толщину, содержит нервные клетки и состоит из 3 слоёв. Белое вещество образовано нервными волокнами и клетками нейроглии и имеет волокнистую структуру.
Найдите в центре серого вещества хорошо видимые крупные тела клеток Пуркинье ******* (син. — грушевидная клетка, «клетка-олень»), составляющих ганглиозный слой, занимающий в сером веществе центральное положение. Выше клеток Пуркинье лежит молекулярный слой, ниже – зернистый слой. Обратите внимание на разную структуру молекулярного и зернистого слоёв.
В зернистом слое хорошо видны многочисленные тела клеток-зёрен и клеток Гольджи. Клетки молекулярного слоя имеют меньшую величину, что и определяет видимую структуру.
Найдите в белом веществе нервные волокна, кровеносные сосуды.
Большое увеличение. Изучите строение слоёв серого вещества. Изучите строение клеток Пуркинье, найдите перикарион, аксон и дендриты. Изучите строение клеток молекулярного и зернистого слоев серого вещества.
Изучите строение белого вещества.
Рисунки в атласе: №№157а, б, в.
Препарат зарисовать и на рисунке обозначить:
1. Серое вещество:
1.1. молекулярный слой;
1.2. ганглиозный слой:
1.2.1. клетки Пуркинье;
1.3. зернистый слой;
1.4. кровеносный капилляр.
2. Белое вещество:
2.1. нервные волокна;
2.2. кровеносный капилляр.
Зарисовать схемы:
Схема 1. Цито- и миелоархитектоника коры больших полушарий головного мозга.
Схема 2. Цито- и миелоархитектоника коры мозжечка.
ПРЕПАРАТ № 120. Пластинчатое нервное тельце (тельце Фатера-Пачини).
Окраска: гематоксилин и эозин.
Изучите препарат без микроскопа. Препарат представляет собой срез кусочка поджелудочной железы, в соединительной ткани которой содержатся нервные окончания — тельца Фатера-Пачини. Тельце Фатера-Пачини – это инкапсулированное чувствительное нервное окончание (рецептор).
Малое увеличение. Пластинчатое нервное окончание располагается в соединительной ткани и имеет вид крупных, слоистых, колбовидных образований, состоящих из концентрических пластин. Тельце Фатера-Пачини имеют круглую форму на поперечном срезе и овоидную — на продольном. Изучите строение нервного окончания.
Большое увеличение. Изучите строение рецептора, найдите ветвление дендрита, внутреннюю колбу, наружную колбу, состоящую из концентрических пластин и нейроглиальных клеток, наружную соединительнотканную капсулу.
Рисунки в атласе: №143.
Препарат зарисовать и на рисунке обозначить:
1. Тельце Фатера-Пачини:
1.1.наружная соединительно-тканная капсула тельца;
1.2.внутренняя колба тельца;
1.3.ветвления дендрита чувствительной клетки спинального ганглия.
ПРЕПАРАТ № 121. Интрамуральный ганглий.
Окраска: гематоксилин и эозин.
Изучите препарат без микроскопа. Препарат представляет собой срез стенки внутреннего органа. На малом увеличении изучить стенку внутреннего органа (мочевой пузырь, пищевод).
Малое увеличение. Найдите гладкую мышечную ткань в составе мышечной оболочки внутреннего органа. Гладкие миоциты располагаются пучками и разделяются прослойками соединительной ткани. При внимательном изучении соединительно-тканных прослоек можно увидеть небольшие скопления нервных клеток, окруженные соединительнотканной капсулой и представляющие собой интрамуральный нервный вегетативный ганглий.
Большое увеличение. Изучите строение интрамурального ганглия. Найдите соединительнотканную капсулу ганглия, нервные клетки Догеля. Обратите внимание структуру цитоплазмы и ядер нейронов, найдите в ядрах ядрышки. Найдите клетки нейроглии, располагающиеся между нейронами.
Рисунки в атласе: №155.
Препарат зарисовать и на рисунке обозначить:
1. Вегетативный нервный ганглий:
1.1. соединительно-тканная капсула ганглия;
1.2. нервные клетки;
1.3. глиоциты (сателлиты);
1.4. нервные волокна.
2. Прослойки рыхлой соединительной ткани.
3. Гладкая мышечная ткань.
Зарисовать схемы:
Схема 1. Нейронный состав вегетативного ганглия
Схема 2. Связь вегетативного ганглия с центральной нервной системой.
Изучить схемы строения чувствительных и двигательных нервных окончаний. Зарисовать схемы:
Схема 3. Свободно ветвящееся чувствительное нервное окончание в эпителии.
Схема 4. Древовидное чувствительное нервное окончание в соединительной ткани.
Схема 5. Бивалентное чувствительное нервное окончание в эпителии и соединительной ткани.
Схема 6. Тельце Фатера-Пачини.
Схема 7. Генитальное тельце.
Схема 8. Мейсснерово тельце.
Схема 8. Меркелевское тельце.
Схема 9. Нервно-мышечное веретено.
Схема 10. Сухожильно-мышечное веретено.
Схема 11. Двигательное нервное окончание в железистом эпителии.
Схема 12. Двигательное нервное окончание в гладкой мышечной ткани.
Схема 13. Двигательное нервное окончание в поперечно-полосатой мышечной ткани.
* Фатер Абрахам (1684-1751), немецкий анатом, описал нервные окончания.
** Пачини Филиппо (1812-1883), итальянский анатом и гистолог, описал нервные окончания в коже пальцев.
*** Гольджи Камилло (1844-1926), итальянский гистолог, лауреат Нобелевской премии, описал типы нервных клеток, нервные окончания в сухожилиях, звездчатые клетки нейроглии, лимфатическую систему мозга, разработал метод импрегнации нервной ткани серебром.
**** Догель Александр Станиславович (1852-1922), российский гистолог, работал на кафедре гистологии Казанского, Томского, Санкт-Петербургского университетов, изучал строение нервной системы и органов чувств.
***** Рамон-и-Кахаль Сантьяго, (1852-1934), испанский нейрогистолог, лауреат Нобелевской премии, сформулировал основные анатомические, гистологические и физиологические принципы нейронной организации нервной ткани, предложил метод импрегнации нервной ткани серебром.
****** Бец Владимир Алексеевич (1834-1889), российский анатом, исследовал гистологическое строение коры головного мозга, разработал методики изготовления срезов коры полушарий головного мозга человека и животных, описал двигательную зону коры головного мозга, создал атлас строения головного мозга.
******* Пуркинье (Пуркине) Ян (Йоханнес) Евангелиста (1787-1869), чешский физиолог, морфолог, микроскопические исследования ученого охватывали почти все органы и ткани: основные труды посвящены физиологии органов чувств, сконструировал микротом, усовершенствовал микроскоп, ввел в гистологическую технику бальзам, краситель индиго, разработал методы: просветления тканей, изготовления шлифов зубов, декальцинации зубов; создал первые микроинструменты для манипуляций на живой клетке и изучил движение ресничек мерцательного эпителия, определил понятие «цитоплазма», описал ядро клетки, осевой цилиндр нервного волокна, дендриты нейронов, нейроны спинного, головного мозга, мозжечка, клетки проводящей системы сердца, потовые железы, строение яйцевода, костей, зубов.
Источник: lektsia.com