библиографическое описание:
Общие принципы и методы окрашивания гистологических препаратов — .
код для вставки на форум:
В основе окрашивания клеток и тканей лежат физико-химические процессы (диффузия, адсорбция, абсорбция, растворимость и др.), происходящие как в красителе, так и в микроструктурах. Большое значение имеют плотность ткани и дисперсность красителя, которые определяют последовательность и скорость окрашивания.
Целью окрашивания является более отчетливое выявление различных компонентов клеток и тканей. Некоторые красители обеспечивают этот эффект, растворяясь в выявляемых компонентах, например нейтральных жирах. Другие красители вызывают химическую реакцию, например выявление железа с образованием берлинской лазури в кислой среде. Во многих случаях процесс окрашивания возможен только при наличии протравы, например гематоксилин окрашивает ткань в присутствии солей металлов.
В гистологической практике применяют основные, кислотные и нейтральные красители. Основные, или ядерные, красители — это основания или их соли, которые окрашивают структуры кислой природы (хроматин ядер, ядрышко и др.) и называются базофильными. К ним относятся гематоксилин, тионин, кармин, метиловый зеленый и др.
МИЕЛИНОВОЕ ВОЛОКНО | Разбор гистологического препарата
Кислотные красители — это кислоты или их соли, с помощью которых выявляют вещества и структуры основной природы (цитоплазматические структуры клеток, эритроциты и т.д.). Таковыми являются эозин, кислый фуксин, Конго красный (конгорот), эритрозин. Нейтральные красители: судан III, судан IV, метиленовый синий.
Процесс гистологического окрашивания условно подразделяют на прогрессивный и регрессивный, прямой и непрямой, простой и сложный. При прогрессивном типе окрашивания процесс идет до тех пор, пока не достигается интенсивное проникновение красителя в ткань. Регрессивный тип основан на первоначальном перекрашивании структур с последующей дифференцировкой до нужного уровня.
Если раствор красителя непосредственно действует на ткань, то говорят о прямом окрашивании. Окрашивание после предварительной подготовки ткани (протравливания) называется непрямым. Окрашивание одним красителем — простое, а при использовании нескольких красителей — сложное.
Для получения оптимальных результатов окрашивания гистологических препаратов нужно использовать растворы, приготовленные в точном соответствии с рекомендуемой прописью. Перед приготовлением нужно внимательно осмотреть реактивы, так как возможны изменение цвета, окисление, кристаллизация и т.п.
По мере инактивации, разбавления и изменения концентрации растворов красителя при длительном использовании его необходимо своевременно заменять свежим. Для хранения красителей и проведения окраски применяют химически чистую маркированную посуду. После приготовления новых порций красителя, особенно при использовании различных партий реактивов окраску нужно контролировать под микроскопом. Продолжительность окрашивания реактивами различных фирм варьирует.
Гистология. Как проводится исследование?
похожие статьи
Атлас по судебно-медицинской гистологии / Пиголкин Ю.И., Кислов М.А., Должанский О.В., Филиппенкова Е.И., Крупин К.Н. — 2021.
Анализ недостатков судебно-гистологических исследований и пути их устранения / Гедыгушева Н.П., Буланова Э.В. // Матер. IV Всеросс. съезда судебных медиков: тезисы докладов. — Владимир, 1996. — №2. — С. 47-49.
Возможности установления некоторых причин смерти гистохимическими методами / Смирнов В.В., Смирнов В.В. // Матер. IV Всеросс. съезда судебных медиков: тезисы докладов. — Владимир, 1996. — №2. — С. 31-32.
Актуальные вопросы гистологического исследования при экспертизе живых лиц / Кулеша Н.В. // Избранные вопросы судебно-медицинской экспертизы. — Хабаровск, 2018. — №17. — С. 125-128.
Источник: www.forens-med.ru
4. Цель и принципы окрашивания гистологического препарата.
Клетки и ткани животного происхождения обладают избирательной способностью к красителям. Поэтому окрашивание срезов необходимо производить для того, чтобы в преломляющем свете микроскопа можно было отчетливо рассмотреть различные тонкие структуры объекта. В неокрашенных срезах можно рассмотреть только такие части, которые отличаются друг от друга различными преломлением световых лучей. Выявление невидимых на срезе деталей строения основано на неодинаковом (избирательном) их отношении к различным красителям.
5. Свойства красителей, принципы окрашивания.
Красители классифицируются по происхождению и химическому составам. По свойствам они делятся на группы кислых и основных красителей. Одни структуры среза вступают в реакцию с кислыми красителями т.е. обладают оксифильными (ацидофильными) свойствами. К группе кислых красителей относятся: кислый фуксин, пикрофуксин, пикриновая кислота, эозин.
Чаще всего мы будем изучать срезы, обработанные эозином, который окрашивает цитоплазму, оболочку клеток, межклеточное вещество соединительной ткани в розовый цвет. По происхождению — эозин искусственный краситель.
К группе основных (базофильных) красителей, с которыми реагируют базофильные компоненты клеток и межклеточного вещества кислой природы (РНК, ДНК, гиалуроновая к-та и др.). относятся: кармин, сафранин, метиловый синий, азур, гематоксилин ( по способу приготовления краски различают гематоксилин Майера, Бемера. Вейгерта, железный гематоксилин Гейденгайна и др.).
Красящим свойством обладают не сам гематоксилин, а продукт его окисления. Гематоксилин окрашивает базофильные структуры в синий или фиолетовый цвет. Этот краситель растительного происхождения, который добывается из кампешевого дерева, растущего в Америке и у нас в Армении. Гематоксилин выявляет четко ядра клеток.
Изучаемые нами препараты чаше всего будут окрашены гематоксилин-эозином. Кармин, также ядерный краситель, но животного происхождения, вырабатывается из насекомых кошенели, живущих на кактусовых деревьях. Большинство же красителей получены синтетическим путем (искусственные краски).
Имеются красители со специальными свойствами, позволяющие выявить ее компоненты, окрашиваемые черным цветом (импрегнация солями серебра – для окраски нейронов, судан черный, осмиевая кислота выявляют липиды). Гликоген выявляется кармином Беста или шик реакцией по мак-Манусу. В данном случае, мы видим в срезах не сам гликоген, а продукт реакции его с красителем, просматривающийся в виде гранул лилово-красного цвета.
Изготовление гистологического препарата.
Процесс обработки материала для изготовления гистологических препаратов слагается из следующих этапов:
1. Взятие материала. Из органа вырезается кусочек, размеры которого не должны превышать 1 куб. см.
2. Фиксация материала. Фиксация проводится для того, чтобы остановить в тканях протекающие жизненные процессы и предупредить последующий их распад. Фиксирующие жидкости: 10-12% раствор формалина в воде (фиксировать от 3 часов до 1 суток и более).
3. Обезвоживание материала, обезжиривание и уплотнение его. Этот процесс осуществляется в спиртах возрастающей крепости и в растворах спирта с эфиром в следующей последовательности: зафиксированный кусоочек материала проводят через батарею спиртов: 5-. 70, 96 градусов (две порции), абсолютный спирт, абс. спирт + эфир) (две порции). В каждом отмеченном растворе кусочек находится не менее суток.
4. Заливка материала. Заливка производится в парафин, целлоидин или желатину. Наиболее распространенный способ заливки в целоидин. Для этого готовится раствор целлоидина разной консистенции (измельченная кинолента растворяется в смеси 100 спирта с эфиром в соотношении 1:1).
Обезвоженный, уплотненный кусочек материала проводится в 3-х порциях целлоидина возрастающей крепости. В каждой порции раствора целлоидином кусочек материала переносят в плоскодонную чашку, которую до краев заполняют густым раствором целлоидина. В чашке кусочек органа, пропитанный целлодином, подсыхает до плотности рога и оказывается залитым в целлоидин. Залитый материал может долго храниться.
5. Приготовление гистологических срезов. Залитый в целлоидин кусочек материала наклеивают на блок (деревянный или стеклянный кубик), укрепляют на предметном столике микротома (микротом-прибор оснащенный бритвой для приготовления гистологических срезов) и бритвой производятся срезы, толщина которых не должна превышать 10-12 микрон. Каждый студент должен самостоятельно сделать 3-4 среза.
6. Окраска гистологических срезов. Различные тканевые элементы избирательно относятся к красителям, что, позволяет их дифференцирование окрасить. Ядра клеток прочнее окрашиваются основными красителями (гематоксилин, азур, кармин и др.). Цитоплазма красителя кислыми красителями (эозин, фуксин, аналин и др.).
7. Обезвоживание, просветление окрашенных срезов и заливка их в бальзам. Окрашенные срезы обезвоживают в 2-х порциях 96 спирта, просветляют в карболе-ксиоле. переносят посредством шпателя на предметное стекло, наносят на срез каплю бальзама и покрывают покровным стеклом.
Препарат готов для исследования может храниться долгое время.
Каждый студент должен самостоятельно в течение семестра освоить технику изготовления гистопрепаратов и приготовить к итоговому зачету по общей гистологии гистосрезы того или иного органа. Работа будет проводиться под руководством сотрудника в научной лаборатории кафедры морфологии.
Источник: studfile.net
Проведение окрашивания
При окраске водными красителями срезы переносят из дистиллированной воды, а при окраске спиртовыми – из спирта соответствующей концентрации, непосредственно в красящий раствор (прямое окрашивание) или сначала в жидкость для протравки (непрямое окрашивание). Когда препарат приобретает
нужную интенсивность окраски, его промывают в воде (или спирте) для удаления избытка красителя, а затем, если нужно, дифференцируют в соответствующей жидкости. Излишний краситель отмывают до тех пор, пока он не перестает переходить из среза в отмывающую жидкость.
Окрашивание срезов, наклеенных на стекло, проводят путем помещения их в красящий раствор. Для этого специальные кюветы, позволяющие красить одновременно большое количество стекол, проводят по схеме в высоких стаканчиках с краской.
Для того чтобы окрашенный препарат можно было исследовать в проходящем свете и дольше хранить, он должен быть прозрачным и защищен от высыхания, загрязнения и повреждения.
Все эти условия обеспечивают просветлением и заключением препарата в специальные срезы.
Просветление н заключение срезов
Просветление делает препараты прозрачными, проходимыми для лучей света и потому удобными для исследования. Различают две группы просветляющих веществ в зависимости от того, способны ли они просветлять срезы после извлечения их из воды или только после обезвоживания спиртом.
Первую группу веществ, т. е. просветляющих срезы после воды, составляет глицерин, глицерин-желатина и т. д. и ряд сложных специально приготовленных сред, как то: фаррактова жидкость, масса Апатии. Подобные просветляющие вещества обычно употребляют при некоторых специальных методах исследования, например на липиды, амилоиды. В этом случае окрашенный срез извлекают из воды на предметное стекло, расправляют, удаляют избыток воды вокруг среза тряпкой, кладут каплю глицерина или другое просветляющее вещество из этой группы и покрывают покровным стеклом. Можно применять этот метод и для различных ориентировочных исследований.
Ко второй группе веществ (просветляющих срезы после спирта) относятся ксилол, толуол, эфирные масла, карболксилол, карболтолуол и т. д.
Для просветления срезов чаще всего пользуются веществами второй категории, так как они обладают более высоким просветляющим эффектом и дают прочные препараты. По этой последней причине срезы после окрашивания подвергают спиртовой обработке, то более, то менее тщательной смотря по тому, с каким просветляющим средством приходится работать.
Так, например, ксилол и толуол весьма чувствительны к качеству обезвоживания срезов и поэтому здесь показано применение абсолютного спирта. Креозот, эфирные масла, карболксилол в этом отношении менее чувствительны, они легко просветляют и после 960 спирта. Все просветляющие вещества обладают теми или иными неблагоприятными свойствами, проявляющимися иногда при длительном хранении препаратов. Один из них вызывает пожелтение препаратов (креозот), другие сильно морщат срезы (ксилол, толуол, карболксилол) и, наконец, почти все они, за исключением ксилола и толуола, в той или иной степени извлекают различные синтетические (анилиновые) красители и поэтому имеют ограничения.
На основании вышеизложенного, делаем вывод, что большим достоинством ксилола и толуола является их абсолютно индифферентность к любым красителям.
В практической работе при простых окрасках (гематоксилин-эозин, по Ван-Гизону) и многих специальных методах исследования для целей просветления удобнее всего пользоваться комбинацией просветляющих средств, т. е. просветлять срез вначале веществом, не требующим абсолютного спирта (эфирное масло, креозот, карболксилол), а затем быстро в течение 1 минуты, обрабатывать ксилолом, применяя его повторно. В просветляющем веществе срез держат до тех пор, пока он не станет совсем прозрачным.
На черном фоне стола непросветленные участки среза представляют в виде беловатых пятен. Эта операция занимает от 15-20 секунд до нескольких минут. Быстрота просветления препарата зависит от крепости употреблявшегося спирта и тщательности обработки им. При неудовлетворительной спиртовой обработке, а также для более скорого просветления показано повторное применение просветляющего вещества, которое в этом случае часто комбинируют с быстрым просушиванием среза втрое или вчетверо сложенной фильтровальной бумагой.
Просветленные и обработанные ксилолом срезы заключают в специальные срезы.
Для заключения гистологических срезов используют такие вещества, как канадский и пихтовый бальзамы, канифоль, гумми — сироп, глицерин и др. Одни из них являются веществами дефицитными, другие обладают существенными недостатками.
Применение пластических масс для заключения гистологических срезов позволяет отказаться от всех перечисленных выше веществ и от покровных стекол, т. к. пластмасса пропитывает срез и одновременно покрывает его тонким слоем сверху, заменяя тем самым покровное стекло.
Полистирол
Полистирол представляет собой пластическую массу, растворимую в ксилоле, бензоле, толуоле и потому пригодную для заключения срезов, окрашенных гематоксилин — эозином, по Ван-Гизону и т. п. С завода полистирол получают в виде отдельных, твердых, прозрачных кусочков.
Для заключения гистологических срезов следует пользоваться 30% раствором полистирола в ксилоле (толуоле), который имеет консистенцию густого меда и совершенно прозрачен. Хранить его надо в банке с притертой пробкой во избежание испарения ксилола и загустения раствора.
Если последний со временем станет слишком густым, к нему добавляют ксилол, если же раствор окажется жидким, нужно дать возможность улетучится части растворителя. При нанесении раствора полистирола на стекло черезминут образуется прозрачная прочная пленка. В быстроте образования пленки состоит большое преимущество полистирола: однако пленка обладает существенными недостатками: она хрупкая, ломкая и плохо прилегает к стеклу. Для устранения этих недостатков к раствору полистирола необходимо добавить так называемый пластификатор — вещество, придающее эластичность и гибкость полистироловой пленке, а также значительно увеличивающее её способность прилипать к стеклу. В качестве пластификатора следует применять дибутилсебацинат.
Дибутилсебацинат представляет собой бесцветную маслянистую жидкость, которая при обычной температуре практически не испаряется и придает эластичность и гибкость полистироловой пленке и очень долгое время. В готовый раствор полистирола следует добавить пластификатор в таком количестве, чтобы раствор последнего в полистироле был равен 6% (т. е. на 100 мл раствора полистирола добавляется 6 мл пластификатора). Скорость образования пленки при добавлении пластификатора почти не изменяется (она образуется через 40-60 минут), однако пленка получается эластичной, не трескается, не ломается и плотно прилегает к предметному стеклу.
Методика заключения срезов в полистирол: рез, извлеченный на предметное стекло из карболксилола, покрывается несколькими каплями раствора полистирола. Наносить раствор можно стеклянной палочкой из маленькой бутылочки, куда предварительно наливается небольшое количество полистирола из основного запаса раствора и равномерно распределяется по стеклу. Пока не образовалась прочная сухая пленка, срез следует предохранять от попадания пыли.
После данных процедур препарата можно исследовать под световым микроскопом. Помещенные под стекло срезы для светового микроскопа могут долго хранится и многократно использовать.
Заключение
Гистологическое исследование аутопсийного, биопсийного материала, а также органов тканей, удаленных при хирургических операциях ставит перед собой цель определения характера патологического процесса. Значение этого метода исследования трудно переоценить, так как он позволяет уточнить диагноз, определить морфологические особенности патологического процесса. На основании полученных данных врач имеет возможность избрать наиболее правильную тактику лечения больного. Особенно важное значение имеет биопсия при определении опухолей, когда малейшая невнимательность и неточность могут послужить причиной роковой ошибки. При работе с биопсийным материалом от лаборанта-гистолога требуется предельная собранность и четкость.
Общие принципы и методы окрашивания гистологических препаратов
В основе окрашивания клеток и тканей лежат физико-химические процессы (диффузия, адсорбция, абсорбция, растворимость и др.), происходящие как в красителе, так и в микроструктурах. Большое значение имеют плотность ткани и дисперсность красителя, которые определяют последовательность и скорость окрашивания.
Целью окрашивания является более отчетливое выявление различных компонентов клеток и тканей. Некоторые красители обеспечивают этот эффект, растворяясь в выявляемых компонентах, например нейтральных жирах. Другие красители вызывают химическую реакцию, например выявление железа с образованием берлинской лазури в кислой среде. Во многих случаях процесс окрашивания возможен только при наличии протравы, например гематоксилин окрашивает ткань в присутствии солей металлов.
В гистологической практике применяют основные, кислотные и нейтральные красители. Основные, или ядерные, красители — это основания или их соли, которые окрашивают структуры кислой природы (хроматин ядер, ядрышко и др.) и называются базофильными. К ним относятся гематоксилин, тионин, кармин, метиловый зеленый и др.
Кислотные красители — это кислоты или их соли, с помощью которых выявляют вещества и структуры основной природы (цитоплазматические структуры клеток, эритроциты и т.д.). Таковыми являются эозин, кислый фуксин, Конго красный (конгорот), эритрозин. Нейтральные красители: судан III, судан IV, метиленовый синий.
Процесс гистологического окрашивания условно подразделяют на прогрессивный и регрессивный, прямой и непрямой, простой и сложный. При прогрессивном типе окрашивания процесс идет до тех пор, пока не достигается интенсивное проникновение красителя в ткань. Регрессивный тип основан на первоначальном перекрашивании структур с последующей дифференцировкой до нужного уровня.
Если раствор красителя непосредственно действует на ткань, то говорят о прямом окрашивании. Окрашивание после предварительной подготовки ткани (протравливания) называется непрямым. Окрашивание одним красителем — простое, а при использовании нескольких красителей — сложное.
Для получения оптимальных результатов окрашивания гистологических препаратов нужно использовать растворы, приготовленные в точном соответствии с рекомендуемой прописью. Перед приготовлением нужно внимательно осмотреть реактивы, так как возможны изменение цвета, окисление, кристаллизация и т.п.
По мере инактивации, разбавления и изменения концентрации растворов красителя при длительном использовании его необходимо своевременно заменять свежим. Для хранения красителей и проведения окраски применяют химически чистую маркированную посуду. После приготовления новых порций красителя, особенно при использовании различных партий реактивов окраску нужно контролировать под микроскопом. Продолжительность окрашивания реактивами различных фирм варьирует.
Ацидофилия
Ацидофилия (от лат. acidus — кислый и греч. phileo — люблю)
(биол.), способность клеточных структур окрашиваться кислыми красителями: эозином, кислым фуксином, пикриновой кислотой и др. Такие структуры называются оксифильными, эозинофильными, фуксинофильными и т. д. Причина А. заключается главным образом в основных (щелочных) свойствах окрашивающихся элементов. А. используется для различения клеточных структур, например при анализе клеток крови. Ср. Базофилия.
Базофилия
(от др.-греч. βάσις основание и φιλία — дружба, любовь, склонность) — химическое сродство коснованиям, в том числе, к осно́вным красителям. Базофилией в гистологии называют способностьклеточных структур окрашиваться основными (щелочными) красителями (азуром, пиронином,гематоксилином и др.), обусловленная кислотными свойствами окрашивающихся компонентов клетки,главным образом нуклеиновых кислот (ДНК и РНК). Повышение базофилии клетки обычно свидетельствует опроисходящем в ней интенсивном белковом синтезе. Базофилия свойственна растущим, регенерирующим,опухолевым тканям. Используется для различения клеток крови (см. базофилы), анализа клеток переднейдоли гипофиза, островковой ткани поджелудочной железы и.т.д.
Нейтрофилия
Нейтрофильные гранулоциты или нейтрофилы, сегментоядерные нейтрофилы, нейтрофильные лейкоциты — подвид гранулоцитарных лейкоцитов, названный нейтрофилами за то, что при окраске по Романовскому они интенсивно окрашиваются как кислым красителем эозином, так и основными красителями, в отличие от эозинофилов, окрашиваемых только эозином, и от базофилов, окрашиваемых только основными красителями.
Источник: megaobuchalka.ru