Принцип метода. Нуклеиновые кислоты в клетке находятся в виде нуклеопротеиновых комплексов, которые рассматриваются как сложные белки, простетической группой которых являются нуклеиновые кислоты. Для качественного анализа химического состава нуклеопротеинов может быть использован гидролизат дрожжей как объект, богатый нуклеопротеинами.
При частичном гидролизе нуклеопротеины распадаются на белок (протамины и гистоны) и нуклеиновые кислоты. При полном гидролизе нуклеиновые кислоты распадаются на составляющие их компоненты по схеме:
| Нуклеиновые кислоты (полинуклеотиды) | ||
| ↓ | ||
| Мононуклеотиды | ||
| ↓ | ||
| Пуриновые или пиримидиновые основания | Рибоза или дезоксирибоза | Фосфорная кислота |
Для изучения компонентов нуклеопротеинов удобно использовать растительный объект-пекарские дрожжи. Продукты кислотного гидролиза нуклеопротеинов могут быть обнаружены специфическими реакциями: биуретовой реакцией обнаруживают наличие полипептидов в гидролизате, пуриновые основания дают специфическую реакцию образованияосадка солей серебра, фосфорную кислоту обнаруживают по реакции с молибдатом аммония, рибозу или дезоксирибозу-с помощью реакции Троммера.
Мочевая кислота и подагра. Почему растет мочевая кислота? Врач эндокринолог диетолог Ольга Павлова
Ход определения.
1. Биуретовая реакция на полипептиды. К 5 каплям гидролизата добавляют 10 капель 10%-ного раствора NaOH и 1 каплю 1%-ного раствора сульфата меди (II)/ Жидкость окрашивается в фиолетовый цвет.
2. Серебряная проба на пуриновые основания. 10 капель гидролизата нейтрализуют 1 каплей концентрированного аммиака и добавляют 5 капель 1%-ного раствора нитрата серебра. При стоянии через 3-5 минут выпадает небольшой рыхлый осадок серебряных соединений пуриновых оснований (аденина, гуанина), окрашенный в бурый цвет.
3. Проба Троммера на рибозу и дезоксирибозу. К 5 каплям гидролизата 10 капель 30%-ного раствора NaOH и 1-3 капли 7%-ного раствора сульфата меди до появления неисчезающей мути гидроксида меди (II). Жидкость перемешивают и верхний слой ее нагревают до начала кипения. Выпадает красный осадок оксида меди (I) или желтый осадок гидроксида меди (I) вследствие окисления рибозы и восстановлением Cu 2+ до Cu + .
4. Молибденовая проба на фосфорную кислоту. К 20 каплям молибденового реактива (раствор молибдата аммония в азотной кислоте) добавляют 2-3 капли гидролизата и кипятят несколько минут на открытом огне. В присутствии фосфорной кислоты жидкость окрашивается в лимонно-желтый цвет. При охлаждении выпадает желтый кристаллический осадок комплексного соединения фосфорномолибденового аммония:
Оформление работы. Результаты лабораторной работы записывают в рабочую тетрадь в виде таблицы:
Источник: studopedia.ru
Лабораторная работа №7
Цель работы – закрепить теоретические знания по теме «Нуклеиновые кислоты и нуклеопротеиды» и приобрести навыки качественного определения компонентов нуклеиновых кислот, образующихся в результате гидролиза нуклеопротеидов.
Биохимия. Лекция 45. Обмен азотистых оснований и нуклеотидов. Обмен пуринов
Для изучения состава нуклеопротеидов проводят кислотный гидролиз дрожжей в присутствии серной кислоты. При непродолжительном гидролизе нуклеопротеиды распадаются на белок и нуклеиновые кислоты. При продолжительном гидролизе наступает полный распад нуклеопротеидов. С помощью специальных реакций можно открыть в гидролизате составные части нуклеопротеидов.
Биуретовой реакцией устанавливают наличие полипептидов. Пуриновые основания обнаруживают по осадку серебряных солей, фосфорную кислоту – по реакции с молибдатом аммония, а пентозу – пробой Троммера.
Исследуемый материал: пекарские дрожжи.
- 10% раствор серной кислоты.
- Аммиак концентрированный.
- 2% аммиачный раствор нитрата серебра (к 2% раствору нитрата серебра добавляют концентрированный раствор аммиака до растворения осадка).
- 10% раствор NaOH.
- 7% раствор CuSO4.
- 1% раствор CuSO4.
- Молибдат аммония в азотной кислоте (7,5 г молибдата аммония растворяют в 100 мл воды и добавляют 100 мл 32% раствора азотной кислоты; полное растворение молибдата аммония происходит после добавления азотной кислоты).
- 1% раствор аскорбиновой кислоты на 1М растворе HCl.
- Большая пробирка или круглодонная колба с пробкой, в которую вставлена длинная стеклянная трубка.
- Песчаная баня.
- Штатив с пробирками.
- Пипетки.
- Индикаторная бумага.
Ход работы. Помещают 1 г пекарских дрожжей в большую пробирку или круглодонную колбу, добавляют 20 мл 10% раствора серной кислоты и 20 мл дистиллированной воды, закрывают пробкой с длинной стеклянной трубкой и кипятят под тягой в течение часа. После прекращения кипячения охлаждают, фильтруют. С фильтратом проделывают качественные реакции на определение составных частей нуклеопротеидов.
1. Серебряная проба на пуриновые основания
Метод основан на способности пуриновых оснований с аммиачным раствором нитрата серебра образовывать осадок серебряных солей пуриновых оснований, окрашенных в светло-коричневый цвет.
гуанин серебряная соль гуанина
Нейтрализуют 10 капель гидролизата 1 каплей концентрированного аммиака и добавляют 5 капель 2% аммиачного раствора нитрата серебра. При стоянии через 3–5 минут выпадает небольшой бурый осадок серебряных производных пуриновых оснований.
2. Проба Троммера на пентозы
Метод основан на окислении альдегидной группы рибозы и дезоксирибозы до карбоксильной, при этом гидроксид меди (II) восстанавливается в гидроксид или оксид меди (I) и выпадает в осадок.
К 10 каплям гидролизата добавляют 5 капель 10 % раствора NaOH до щелочной среды и добавляют по каплям 7% раствор сульфата меди CuSO4 до появления голубой мути, далее пробирку нагревают до кипения, при этом выпадает желтый осадок CuOH или образуется осадок меди Cu2O красного цвета. Внимание! Избыток CuSO4 мешает реакции, так как образующийся при нагревании Cu(OH)2 дает оксид меди (II) CuO черного цвета.
рибоза рибоновая кислота
Источник: studfile.net
К 5 каплям гидролизата дрожжей добавляют 10 капель 10 % раствора гидроокиси натрия (NaOH) и 1-2 капли 5 % раствора сульфата меди (II) — CuS04 до появления сине-фиолетовой или красно-фиолетовой окраски раствора.
В отчете следует отметить наблюдения, сделать вывод о наличии в нуклеопротеиде полипептидов.
Опыт 2. Серебряная проба на пуриновые основания
Метод основан на способности пуриновых оснований образовывать с аммиачным раствором нитрата серебра (AgN03) осадок серебряных солей пуриновых оснований (аденина, гуанина), окрашенных в светло-коричневый цвет:
В пробирку вносят 10 капель гидролизата дрожжей, добавляют по каплям концентрированный раствор аммиака (NH4OH) до щелочной реакции по универсальной индикаторной бумаге (1-10 капель) и 10 капель аммиачного раствора нитрата серебра (AgN03), который готовят добавлением концентрированного раствора аммиака к 2-3 % раствору нитрата серебра до растворения осадка. Через 3-5 минут образуется рыхлый бурый осадок серебряных соединений пуриновых оснований.
В отчете следует указать свои наблюдения и сделать вывод о наличии пуриновых оснований в нуклеопротеидах. Какие пуриновые основания в них могут содержаться?
Качественные реакции на пентозы
Опыт 3. Дифениламиновая проба (реакция Дише)
Метод основан на способности дезоксирибозы ДНК образовывать в реакции с дифениламином соединения синего цвета при нагревании в среде, содержащей смесь ледяной уксусной кислоты и концентрированной серной кислоты. С рибозой РНК аналогичная реакция дает зеленое окрашивание.
Для приготовления дифениламинового реактива 1 г дифе- ниланилина растворяют в 100 мл ледяной уксусной кислоты (СН3С02Н) и к полученному раствору добавляют 2,75 мл концентрированной серной кислоты (H2S04).
К 10 каплям гидролизата нуклеопротеидов дрожжей приливают 0,5-1 мл дифениламинового реактива. Содержимое пробирки перемешивают и нагревают на водяной бане в течение 15-20 минут. Отмечают характерное окрашивание раствора.
В отчете следует указать свои наблюдения и сделать вывод о наличии в нуклеопротеидах пентоз. Какие пентозы в них могут содержаться?
Опыт 4. Проба Троммера
Эта проба, как и две последующие, основана на способности рибозы и 2-дезоксирибозы, имеющих свободный гликозидный гидроксил, восстанавливать в щелочной среде окисные формы металлов (Си, Fe, Bi) до закисных, а закисные — до свободного состояния. Сахара же в этих условиях дают различные продукты окисления.
Основана проба Троммера на указанных ниже реакциях.
1. При добавлении водного раствора гидроксида натрия (NaOH) к раствору сульфата меди (II) — CuS04 образуется осадок гидроксида меди (II) — Си(ОН)2 синего цвета:
2. При нагревании в присутствии восстанавливающих сахаров (рибозы, 2-дезоксирибозы) гидроксид меди (II) — Си(ОН)2 восстанавливается до гидроксида меди (I) — СиОН (желтый осадок), затем до Си20 — оксида меди (I), и в конечном результате образуется кирпично-красный осадок.
Избыток сульфата меди (II) — CuS04 мешает реакции, так как ведет к образованию большого количества Си(ОН)2 — гидроксида меди (II), который при нагревании распадается с образованием черного осадка СиО — оксида меди:
К 5 каплям гидролизата дрожжей добавляют 5 капель 30 % раствора гидроксида натрия (NaOH) и несколько капель 7 % раствора сульфата меди (II) — CuS04 до появления неисчезающей мути Си(ОН)2 — гидроксида меди (II). При нагревании до кипения выпадает желтый осадок гидроксида меди (I) — СиОН или кирпично- красный осадок оксида меди (I) — Си20.
В отчете следует записать свои наблюдения, сделать вывод о наличии в нуклеопротеидах пентоз и об их восстанавливающих свойствах и указать, какой особенностью строения обусловлены эти свойства (при затруднении см. в части 1 данного пособия раздел 3).
Опыт 5. Проба Феллинга
Проба Феллинга является модификацией пробы Троммера. В ней используется реактив Феллинга, для приготовления которого в пробирке смешивают 5 капель 7 % раствора сульфата меди (II) — CuS04 и 5 капель раствора сегнетовой соли (345 г KNaC4H406 • 4Н20 — тетрагидрата двойной натриевой-калие- вой соли винной кислоты растворяют в дистиллированной воде), добавляют 140 г гидроксида натрия (NaOH) и доводят водой в мерной колбе до 1 л.
К реактиву Феллинга добавляют 5-7 капель гидролизата дрожжей, перемешивают и нагревают до кипения. Наблюдают выпадение окрашенного осадка.
В отчете следует указать цвет осадка, как изменяется окраска раствора, сделать вывод о наличии в нуклеопротеидах пентоз.
Опыт 6. Реакция Толленса
В отличие от двух предыдущих реакций реакция Толленса является специфичной для пентоз. Она обусловлена взаимодействием флороглюцина с фурфуролом, образующимся из пентозы при нагревании с соляной кислотой (НС1). При этом получается продукт конденсации красного цвета.
В пробирку вносят 5-7 капель гидролизата дрожжей, 2-3 капли 0,5 % раствора флороглюцина в концентрированной соляной кислоте (НС1) и кипятят в течение 1 минуты. Наблюдают за изменением окраски раствора.
В отчете следует отметить, как изменяется окраска раствора, сделать вывод о наличии в нуклеопротеидах пентоз.
Опыт 7. Реакция Молиша
В пробирку вносят 10 капель гидролизата дрожжей, добавляют 3 капли 1 % раствора тимола, затем по стенке пробирки (осторожно!) добавляют 20 капель концентрированной соляной кислоты (НС1) и кипятят в течение 1 минуты. Наблюдают за изменением окраски раствора.
В отчете следует отметить, как изменяется окраска раствора, сделать вывод о наличии в нуклеопротеидах пентоз.
Качественные реакции на фосфорную кислоту
Опыт 8. Молибденовая проба на фосфорную кислоту
Для приготовления молибденового реактива в 100 мл дистиллированной воды растворяют 7,5 г молибдата аммония — (NH4)2 Mo04 и добавляют 100 мл 32 % раствора азотной кислоты (HN03) плотностью 1,2 г/см 3 .
В пробирку вносят 5 капель гидролизата дрожжей, добавляют 10-20 капель молибденового реактива и кипятят в течение нескольких минут. При охлаждении пробирки под струей холодной воды выпадает кристаллический осадок фосфорной соли молибдата аммония лимонно-желтого цвета:
Качественные реакции на лекарственные препараты нуклеотидной природы
В качестве лекарственного препарата нуклеотидной природы используют раствор аденозинтрифосфата (АТФ, средства улучшающего метаболизм и энергообеспечение тканей).
Опыт 9. Обнаружение рибозы в аденозинтрифосфате
Метод основан на обнаружении рибозы с помощью дифенил- аминовой реакции.
В пробирку вносят 5 капель раствора аденозинтрифосфата натрия, прибавляют 10 капель дифениламинового реактива и нагревают 10 минут на кипящей водяной бане.
В отчете отмечают результат реакции, делают вывод о присутствии рибозы в структуре аденозинтрифосфата.
Практическое значение работы
Источник: bstudy.net